Хроматография

Гель-проникающая хроматография (SEC). Лаборатория располагает обширным набором гелей и колонок (производители: BioRad, Tosoh BioScience, Sigma, Pharmacia), позволяющим разделять углеводы по массам в диапазоне от 0,1 до 7000 кДа, а также очищать растворы полисахаридов от солей и других примесей. Хроматографическая система Gilson позволяет проводить гель-фильтрацию при высоком давлении (HPLC).

Система для анионообменной хроматографии высокого давления (HPAEC), имеющаяся в лаборатории (Dionex DX500), оснащена пульс-амперометрическим детектором (PAD ED 40, Dionex) и обессоливателем (CMD-300, 4мм, Dionex), используется для разделения моно- и олигосахаридных смесей (колонки: CarboPac PA-1, РА-200). Широкий набор стандартных олиго- и моносахаридов (производители: Merck, Sigma, Megazyme) обеспечивает точность детектирования и количественной оценки. Наличие углеводного мембранного обессоливателя дает возможность получать отдельные углеводные фракции растворенными в воде. В этом случае единичный моно- или олигосахаридный пик может быть подвергнут дальнейшему анализу, в том числе масс-спектрометрическому или радиоизотопному.

Ниже приведен пример структурного исследования коммерческого препарата глюкана со смешанным типом связей из эндосперма ячменя (Megazyme) с использованием различных видов хроматографии.

Рисунок 1. HPAEC-спектр моносахаров, полученных в результате гидролиза глюкана со смешанным типом связей в 2М ТФУ (120ºС, 1 час).

В состав препарата входит только глюкоза. В данном случае это означает, что в его составе отсутствуют примеси посторонних моно- или полисахаридов. Однако не исключает наличия примесей других глюканов. 

Рисунок 2. Профили элюции глюкана со смешанным типом связей: до (красный) и после (зеленый) обработки ферментом – лихеназой – специфически расщепляющим этот полисахарид. Стрелками обозначены объемы элюции для соответствующих углеводных стандартов.

Исходный глюкан со смешанным типом связей имеет молекулярную массу порядка 130 кДа. После воздействия лихеназы все углеводы переходят в олигосахаридную форму и могут быть подвергнуты HPAEC-анализу. Этот факт служит дополнительным подтверждением чистоты препарата: использовавшийся фермент специфичен, следовательно, глюкан иной природы остался бы не гидролизованным.

Рисунок 3. HPAEC-спектр олигосахаридных фрагментов глюкана со смешанным типом связей. DPn – олигосахаридный фрагмент вида β-D-Glc-1,3-β-D-Glc-(1,4-β-D-Glc)n-2.

Исходя из площадей пиков можно заключить, что под действием фермента глюкан со смешанным типом связей был разрушен до олигосахаридных фрагментов, в состав которых входит от 3 до 9 остатков глюкозы. Состав глюкана со смешанным типом связей представлен в таблице ниже.